Pierwsze udane użycie “nożyczek do DNA” w ludzkim genomie – zupełnie nowe formy terapii genowej wyleczyły dotąd nieuleczalne choroby

Ten ogromny przełom przyniosła technika CRISPR/Cas9, która wykorzystuje niewielkie cięcia w DNA do wstawiania, usuwania czy naprawy genów. Już sama w sobie metoda CRISPR/Cas9 stała się przełomem w genetyce, a teraz rozpoczyna prawdziwą rewolucję w leczeniu chorób genetycznych. Rok 2021 przyniósł pierwsze udane próby takich terapii u ludzi – pisze o tym gościnnie w Crazy Nauce dr Paula Dobosz, szefowa Zakładu Genetyki i Genomiki CSK MSWiA.

Metoda CRISPR/Cas9, nazywana “nożyczkami do DNA” lub “molekularnymi nożycami”, umożliwia niezwykle precyzyjne wykonywanie cięć w DNA celem wstawienia, naprawy lub edycji genów. Twórczynie tej metody, Emmanuelle Charpentier i Jennifer A. Doudna, otrzymały za to odkrycie nagrodę Nobla w 2020 roku. O CRISPR/Cas9 króciutko napisaliśmy w naszym naukowym zestawieniu najważniejszych wydarzeń naukowych 2021 roku i właściwie natychmiast okazało się, że o innowacyjnej, precyzyjnej i dającej przeogromne możliwości technice edycji genomu warto (a nawet trzeba!) napisać oddzielny tekst.

Poprosiliśmy o to osobę najbardziej do tego wskazaną – dr Paulę Dobosz, szefową Zakładu Genetyki i Genomiki CSK MSWiA. Artykuł opatrzyła komentarzami prof. Ewa Bartnik, wybitna genetyczka z Uniwersytetu Warszawskiego. Dla tych, którzy nie wiedzą – obie są cenionymi specjalistkami w tej właśnie dziedzinie i pękamy z dumy, że udzieliły nam swoich głosów. Oddajemy zatem artykuł w Ich ręce.

Od kilku lat z różnych zakątków świata docierają do nas informacje na temat prób prowadzenia metodą CRISPR/Cas9 terapii u ludzi, ale wciąż doszukiwaliśmy się w nich słabych punktów. Taka już natura naukowców, że szukają dziury w całym i za wszelką cenę starają się podważyć nawet własne teorie. Tymczasem wszystko wskazuje na to, że użycie CRISPR/Cas9 może być nie tylko bezpieczne, ale przede wszystkim wysoce efektywne, nawet jeśli specyfik bazujący na tej technologii jest podawany bezpośrednio do krwiobiegu pacjenta. Wydaje się również, że wystarczające będzie jednorazowe przeprowadzenie terapii, a nie powtarzane przez całe życie cykle leczenia.

– CRISPR/Cas9 to świetny punkt wyjścia dla coraz lepszych i bardziej precyzyjnych technik modyfikowania genomu, również u ludzi – mówi prof. Ewa Bartnik, genetyczka z Uniwersytetu Warszawskiego. – Udane zabiegi edycji ludzkiego genomu, prowadzone w 2021 roku u pacjentów z amyloidozą wrodzoną typu ATTR i wrodzoną wadą wzroku, pokazują ogromny potencjał tych metod.

Amyloidoza

Przyjrzyjmy się konkretom: pierwsza z przełomowych terapii dotyczy amyloidozy wrodzonej typu ATTR, a wyniki badań klinicznych na ten temat zostały opublikowane w sierpniu 2021 roku. Amyloidoza transtyretynowa (ang. transthyretin amyloidosis, ATTR) to ogromnie rzadka i potencjalnie śmiertelna choroba genetyczna, powodowana  nieprawidłowym wariantem genu TTR. W wyniku takiej mutacji w wątrobie chorych powstaje białko, które ma inny od pożądanego kształt. W efekcie nie tylko nie jest w stanie pełnić swojej biologicznej funkcji, ale na domiar złego zaczyna się w komórkach gromadzić i powodować dalsze problemy – objawy choroby są wywoływane przede wszystkim akumulacją białka TTR, które dodatkowo potrafią tworzyć włókna – przez co jeszcze bardziej upośledzają działanie organów wewnętrznych pacjenta. Objawy pojawiają się przede wszystkim ze strony układu nerwowego oraz układu krążenia, nasilają się z czasem i prowadzą do niewydolności narządów, a w efekcie do śmierci.

Opisano już przynajmniej 100 różnych mutacji genu TTR, a to zdecydowanie nie wyczerpuje puli możliwości. Jednakże większość z nich dotyczy samej sekwencji genu TTR, zmian pojedynczych nukleotydów, przez co amyloidoza transtyretynowa stała się potencjalnym celem nowych terapii genowych. W teorii wystarczyłoby „zablokować” produkcję feralnego białka, aby objawy ustąpiły albo przynajmniej choroba przestałaby postępować. Eksperymentalną terapię z wykorzystaniem edycji genowej z CRISPR/Cas9 zastosowano u 6 pacjentów z ATTR. U wszystkich zaobserwowano znaczny spadek feralnego białka, powodującego objawy choroby. Znaczny spadek oznaczał średnio 87%, a to naprawdę kolosalna różnica, jeśli mówimy o amyloidozie. Niektórzy pacjenci otrzymali wyższą, a niektórzy niższą dawkę leku. U jednego z pacjentów otrzymujących wyższą dawkę zanotowano spadek produkowanego nieprawidłowego białka TTR aż o 96%. To przerosło najśmielsze oczekiwania samych naukowców, i to tak skutecznie, że na pewien czas dosłownie „zawiesili się” nad analizami wyników badania. Powtarzali oznaczenia, ale wynik nieustająco był fenomenalny.

Przełomową terapię wynaleźli naukowcy z amerykańskiego konsorcjum zrzeszającego przede wszystkim dwie firmy: Intellia Therapeutics (Cambridge, Massachusetts) oraz Regeneron (Tarrytown, New York), a pierwsze wyniki ogłosili światu w połowie 2021 roku podczas konferencji towarzystwa naukowego Peripheral Nerve Society oraz na łamach prestiżowego czasopisma medycznego „The New England Journal of Medicine”.

Nie była to oczywiście pierwsza próba terapii ATTR, choć jak dotąd bez wątpienia najskuteczniejsza. W 2018 roku FDA zaaprobowało dwa leki bazujące na blokowaniu mRNA powstającego na bazie sekwencji genu TTR, jednakże w najlepszym przypadku terapia ta obniżała poziom feralnego białka o 80%, i to tylko tymczasowo. Zazwyczaj było to o wiele mniej skuteczne, a i tak ostatecznie choroba postępowała, choć nieco wolniej. Wydaje się zatem, że samo zablokowanie mRNA może nie być wystarczające lub niezbędne jest częste powtarzanie terapii, co oczywiście wiąże się z wysokimi kosztami i tak niewiarygodnie drogiego leczenia.

Wrodzona wada wzroku

Druga z udanych ingerencji w ludzki genom z pomocą techniki CRISPR/Cas9 dotyczyła terapii innej choroby genetycznej, znanej jako wrodzona ślepota Lebera albo retinopatia Lebera (ang. LCA – Leber congenital amaurosis). Cierpiące na nią osoby stopniowo tracą wzrok już w dzieciństwie na skutek genetycznych nieprawidłowości w fotoreceptorowych komórkach siatkówki lub w pobliskich komórkach, a jako dorośli mogą widzieć tylko niewyraźne, zamazane obrazy bezpośrednio przed sobą lub całkowicie tracą wzrok.

Retinopatia Lebera ma jednak kilkanaście podtypów, w zależności od uszkodzonego genu, co znacznie komplikuje zarówno diagnostykę, jak i same próby leczenia choroby. Pierwsze podejście do terapii genowej choroby miało miejsce w 2008 roku, kiedy to wykorzystano wirusy AAV jako nośniki materiału genetycznego. Choć próby były skuteczne, dopiero technika CRISPR/Cas9 pozwoliła na szeroko zakrojone eksperymenty z innymi podtypami choroby.

W opublikowanym w drugiej połowie 2021 roku artykule opisanych zostało sześciu pacjentów ciepiących na tę chorobę. Zaaplikowano im serię zabiegów z wykorzystaniem metody CRISPR/Cas9. Badanie kliniczne prowadzone od marca 2020 roku przez firmę biotechnologiczną Editas Medicine było pierwszym w historii, które polegało na wstrzyknięciu pacjentom „genetycznych nożyczek” CRISPR/Cas9 w celu edycji DNA i usunięcia patogennego wariantu – czyli tego, który powoduje chorobę. Naukowcy skupili się na najbardziej popularnym typie ślepoty Lebera, LCA10, wywoływanym przez wadliwy wariant genu CEP290, który koduje białko decydujące o działaniu wielu innych białek wokół komórek fotoreceptorowych.

O wynikach badań klinicznych naukowcy poinformowali we wrześniu 2021 roku. Wszyscy uczestnicy eksperymentu doświadczyli pewnej poprawy, ale dwoje spośród sześciu uczestników może teraz lepiej dostrzegać światło, a jedna z nich jest w stanie widzieć obiekty w słabym świetle (i np. poruszać się po labiryncie).

Edycja mitochondrialnego DNA

Choć wszyscy słyszeliśmy o CRISPR/Cas9, musimy pamiętać, że nie jest to ani pierwsza odkryta technika edycji genomu, ani z pewnością nie ostatnia.

– Techniki edycji ludzkiego genomu robią się coraz bardziej subtelne – mówi prof. Ewa Bartnik. – Przykładem tego mogą być badania prowadzone w laboratorium dr. Davida Liu, naukowca związanego m.in. z Broad Institute utworzonym przez Uniwersytet Harvarda i Massachusetts Institute of Technology (MIT), który opracował bardzo wyrafinowany sposób edycji mitochondrialnego DNA a także dwa ulepszenia techniki CRISPR-CAS, prime editing i base editing, które są dużo bardziej precyzyjne od wyjściowej techniki, i na pewno nie powiedział jeszcze ostatniego słowa.

W 2016 roku grupa badaczy pod przewodnictwem wspomnianego wyżej dr. Davida Liu stworzyła nową technikę, będącą niejako modyfikacją systemu CRISPR/Cas9, znacznie ulepszoną i uproszczoną, w ramach której możliwe jest edytowanie pojedynczych nukleotydów w genomie bez konieczności tworzenia podwójnych pęknięć nici DNA, tworzenia dużych insercji lub delecji (co bywa niezbędne w klasycznej postaci techniki CRISPR/Cas9).

Stworzone przez grupę dr. Liu dwie nowe techniki modyfikacji genomu (znane jako adenine base editors, ABEs, oraz cytosine base editors, CBEs) są w stanie naprawiać wszystkie cztery mutacje typu tranzycja (czyli wstawienie nieprawidłowego nukleotydu; zastąpienie puryny inną puryną lub pirymidyny inną pirymidyną). Teraz musimy sobie uświadomić, że tranzycje odpowiadają za blisko 60 proc. wszystkich mutacji patogennych pojedynczego nukleotydu, jakie obserwuje się w chorobach genetycznych człowieka.

Od kiedy dr Liu wprowadził nową technikę do oferty firmy Addgene, z którą współpracuje, a która umożliwia wymianę technologiczną między laboratoriami na świecie, skorzystało z niej ponad 3000 laboratoriów, a liczba pobrań przekroczyła już 9000. W efekcie wykorzystania jego techniki ukazało się już ponad 200 prac naukowych opisujących zastosowanie nowych metod w edycji genomów, i to nie tylko u naczelnych, ale również owadów, ryb, gryzoni, a także roślin i bakterii. Technika znana jest dzisiaj pod nazwą „prime editing” i być może okaże się lepsza od samego CRISPR/Cas9, na przykład z uwagi na większą precyzję działania oraz wyższą wydajność.

Współpraca: Aleksandra Stanisławska